项目文章｜Sci Adv: RALF1
前言
2020 年 5 月 20 日，湖南大学于峰教授和中南林业科技大学林亲录教授作为共同通讯作者，在 Science Advances杂志（IF: 12.804）在线发表了题为“RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants ”的研究论文，深入探究了拟南芥响应细胞外信号进而调控 mRNA 可变剪接的机制。文章中转录组测序及可变剪接分析由欧易生物完成。
研究背景
真核生物基因的可变剪接（AS），丰富了基因的编码能力和转录调控潜能。植物针对体外信号做出响应，以动态调控基因的可变剪接。拟南芥受体蛋白激酶 FERONIA 可以响应其配体 RALF1 小肽信号，调控植物的生长、胁迫响应，影响作物的粮食产量和品质，但 FERONIA 如何响应 RALF1 信号以调控如此多样的细胞内活动仍有待深入研究。本研究从基因可变剪接的角度进行了探究。
研究内容
本研究在拟南芥中通过转录组测序进行可变剪接分析，结果表明细胞外信号 RALF1 可以通过其受体 FER 与 GRP7 蛋白互作并调控 GRP7 磷酸化，进而促进 GRP7 蛋白在细胞核内积累。FER 依赖的 GRP7 磷酸化促进了其与 mRNA 的结合能力、与剪接复合体成员 U1 的结合，最终动态调控 mRNA 的可变剪接。GRP7 自身的可变剪接，通过 NMD 机制负反馈调控 RALF1-FER-GRP7，精细调控对胁迫的响应与细胞生长。RALF1-FER-GRP7 为植物响应外部刺激引起的 mRNA 剪接调控机制提供了一个范式。
研究结果
1. RALF1 调控拟南芥根中基因的可变剪接
利用 RALF1 处理拟南芥 Col-0 的根，进行转录组测序。结果显示，与空白处理对照相比，RALF1 处理后对根中 mRNA 表达量的影响较小，但显著影响了 mRNA 的可变剪接（AS）。共检测到 3401 个显著差异的 AS 事件（左上图），GO 分析表明发生 AS 改变的基因主要参与 DNA 修复、氨基酸合成、胁迫响应、根细胞分化等过程（左下图）。随机选择其中 20 个 AS，，其中 16 个可以利用 semi-PCR 得以验证（右图）。
接下来，为了证明 RALF1 是否通过剪接复合体影响了 AS，分别在剪接复合体突变的 sr45-1 和 lsm8-1、以及 RALF1 受体突变的 fer-4 中进行了检测，结果显示这些突变体中 RALF1 导致的根生长抑制现象均出现一定程度的缓解（下图）。同时实验证实 RALF23 可以起到与 RALF1 类似的根生长抑制作用。
2. FER 与 GRP7 蛋白相互作用
在 RALF1 受体突变体 fer-4 中，对上述受到 RALF1 调控的 AS 进行检测，均显示 AS 的改变不显著，这表明 RALF1 通过其受体 FER 调控可变剪接。酵母双杂交筛选、GST pull-down 和 BiFC 实验表明，FER 可以与 GRP7 蛋白直接相互作用（下图）。
3. RALF1 通过 FER 调控 GRP7 的磷酸化水平
利用 ABA 诱导的体外磷酸化系统检测显示，FER 可以介导 GRP7 的 6 个氨基酸残基发生磷酸化。GRP7 的磷酸化水平随 RALF1 处理而升高，但在 fer-4 突变体中 GRP7 磷酸化不受 RALF1 影响（下图 B）。同时利用 label-free 检测显示 RALF1 在体内主要影响了 GRP7 Ser132 和 Ser139 位点的磷酸化（下图 C-D）。
4. RALF1-FER 通过 GRP7 调控可变剪接
为了研究 GRP7 是否参与了 RALF1 介导的 AS 改变，对 Col-0、fer-4 以及 grp7-1 8i 进行了转录组测序，其中 grp7-1 8i 是一个带有 GRP8 RNAi 载体的 grp7-1 T-DNA 插入突变体。与 Col-0 对照相比，fer-4 中共筛选到 3509 个显著的 AS 事件，grp7-1 8i 中共筛选到 3822 个显著的 AS 事件，有 1164 个 AS 事件同时存在于两组差异结果中，并且两组比较间大部分 AS 差异的趋势相同（下图）。GO 富集分析显示两组共同差异的 AS 主要参与胁迫响应和发育。12 个 AS 中的 11 个可以通过 semi-PCR 得以验证。
同时分析显示，FER、GRP7 突变体中与 RALF1 处理所引起的 Col-0 中 AS 高度一致，表明 RALF1 所引起的 AS 改变部分通过 FER 和 GRP7 来实现。
5. RALF1-FER 通过 FER 介导的 GRP7 磷酸化调控可变剪接
RALF1 处理会抑制植物的根长，而在 fer-4 和 grp7-1 8i 突变体中，对 RALF1 引起的根长抑制变得不敏感。grp7-1 8i 中过表达 GRP7 后能够恢复根长对 RALF1 的响应。在 grp7-1 8i 突变体背景下过表达磷酸化失活突变的 GRP7mut6A，不能够恢复根长对 RALF1 的响应；而在 grp7-1 8i 突变体中过表达磷酸化激活的 GRP7mut6A ，根长相比对照而言对 RALF1 更为敏感（图 D），这表明 FER 介导的 GRP7 磷酸化在 RALF1 响应中至为关键，活性氧反应（图 E）同时验证了上述结论（图 F）。ABA 处理（图 G）也表明，GRP7 和 FER 参与调控植物的胁迫响应，而这一过程同样依赖于 GRP7 的磷酸化。
亚细胞定位显示，RALF1 处理会导致 Col-0 中 GRP7 在细胞核积累（图 A-B），而 RALF1 处理的 fer-4 突变体中 GRP7 在细胞核积累不显著。同样，无论是否经 RALF1 处理，磷酸化位点失活突变的 GRP7mut6A 拟南芥中 GRP7 也较少分布于细胞核中。这表明 RALF1-FER 途径促进了 GRP7 在细胞核中的积累，并且这一过程部分依赖于 FER 介导的磷酸化。酵母双杂交与 BiFC 实验表明，GRP7 可以在细胞核中与剪接复合体的成员 U1 互作（图 C-D）。
EMSA 实验检测表明，GRP7 可以结合到 PUB9、ABF1、LRK10L1.1 mRNA，这些基因都是 ABA 相关基因并且都具有 GRP7 结合 motif。磷酸化的 GRP7 与 mRNA 的结合能力更强（上图 F）。RIP 实验也证实，GRP7 在体内也具有与 mRNA 结合能力，但在 fer-4 突变体中结合能力较弱，RALF1 处理可以增强 GRP7 与 mRNA 的结合（上图 G）。以上结果说明 RALF1 通过促进 FER 介导的 GRP7 磷酸化介导了 GRP7 与 mRNA 的结合能力。
6. RALF1-FER-GRP7 调控的可变剪接的作用
为了研究 RALF1-FER-GRP7 介导的可变剪接的作用，选择 ABA 信号途径中的转录因子 ABF1 为研究目标。前述转录组测序数据显示 ABF1 有两个转录本，其中 ABF1.1 编码 392 个氨基酸，ABF1.2 编码 403 个氨基酸。在 fer-4 和 grp7-1 8i 突变体中，ABF1.1 表达量上升，而ABF1.2 表达量下降，说明 FER 和 GRP7 影响了 ABF 的可变剪接。与对照相比，在 wt 中过表达 ABF1.2 会使拟南芥呈现 ABA 抗性，而过表达 ABF1.1 会使拟南芥对 ABA 更为敏感（图 C-D）。说明 RALF1-FER-GRP7 调控的可变剪接影响对 ABA 的应答。
7. GRP7 AS 转录本表达水平受到 NMD 机制调控
无义介导的 mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）作为真核生物体内的重要调控机制，可以介导可变剪接产生的错义转录本降解。GRP7 也可以通过 NMD 机制进行调控。GRP7 有一个保留了部分内含子的可变转录本 as_GRP7，会导致 GRP7 翻译的提前终止，无法产生有功能的蛋白，最终被 NMD 机制降解。Semi-PCR 显示，相比对照，as_GRP7 在过表达突变型 GRP7mut6D 和野生型 GRP7 中表达水平升高，而在过表达 GRP7mut6A 突变型中表达水平降低，表明 GRP7 的过磷酸化会触发 as_GRP7 产生，而 as_GRP7 有可能会对 GRP7 的蛋白产生负反馈调控。ABA 处理后，GRP7 蛋白水平会显著降低，究其原因发现 ABA 处理后虽然 GRP7 RNA 水平总体上升（图 B），但是 as_GRP7 上升显著，导致 mRNA 降解，引起了蛋白水平的下降（图 C）。由此可以推断 ABA 同样可以通过 NMD 机制动态调控了 GRP7 的表达水平。
研究结论
基于以上结果，本研究提出了拟南芥响应细胞外信号调控 mRNA剪接的作用机制：细胞外信号 RALF1 通过其受体 FER，与 GRP7 结合并介导其磷酸化，磷酸化的 GRP7 在细胞核内积累并与可变剪接复合体结合调控了 mRNA 的可变剪接。而 GRP7 自身也由于发生可变剪接受到 NMD 机制的调控以维持动态平衡，精细调控植物对胁迫的响应。
· 作者简介
林亲录，中南林业科技大学食品学院院长，二级教授，树人学者特聘教授；稻谷及副产物深加工国家工程实验室主任；中组部万人计划人才，国家重点领域“大米深加工与综合利用”创新团队首席专家，课题组近年来联合湖南大学围绕水稻逆境及品质调控研究发表论文多篇。
于峰，湖南大学生物学院教授，博士生导师，副院长，青年长江学者。课题组长期围绕植物环境适宜性机制开展深入研究，该课题组近两年来相继在 PLOS Biology（点击链接查看详情）、Molecular Plant、New Phytologist 等期刊上发表论文多篇。
汪龙，湖南大学首届杰出博士后，博士毕业于中南林业科技大学（导师：林亲录），2018年7月进入湖南大学生物学院开展博士后训练（合作导师：于峰）。以第一作者/并列第一作者在Science Advances, Journal of Experimental Botany等发表论文7篇，授权专利4项。主持中国博士后基金面上项目1项。
参考文献
Wang L, Yang T, Wang B, et al. RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants. Sci Adv 2020; 6(21): eaaz1622.
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郑小辫儿 撰文
本文系欧易生物原创
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