谈人参皂苷Rg3自微乳化微球的制备及影响因素的论文

谈人参皂苷Rg3自微乳化微球的制备及影响因素的论文

海藻酸钠( ALG) 又被称为藻朊钠、褐藻胶或褐藻酸钠，是由天然褐藻或细菌中提取出来的一种天然多糖和阳离子结合形成的钠盐。海藻酸钠以其良好的生物降解性和生物相容性，被广泛应用于各个领域。大量研究显示使用海藻酸钠制备的缓释微球pH 敏感性的特性，而且制得的微球形态圆整、粒径大小适宜。研究表明，人参皂苷Rg3具有较好的抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞浸润、抗肿瘤细胞转移的作用等。但人参皂苷Rg3在水中的几乎不溶，其口服血药浓度很低，故提高药物的溶解度是近来研究的热点。但传统的液体自乳化给药系统是封装在软胶囊或硬胶囊中，生产过程复杂、生产成本高昂、服用不方便; 制剂成分与胶囊壳可能存在相容性问题，长期储存后可能发生胶囊泄露。本实验采取自乳化释药系统，并用静电滴法将其制成微球，以期既提高药物的溶解度，提高生物利用度，又便于服用，同时，考察微球形成的影响因素。

1 试药与仪器

1. 1 药品、试剂

Isopropanol( 色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司) ，Ethyl oleate( 上海千为油脂科技有限公司) ，CremophorRh40( 上海运宏化工制剂辅料技术有限公司，德国BASF 生产) ，Triton X100( 上海凌峰化学试剂有限公司) ，人参皂苷Rg3原料药对照品，由吉林亚泰制药股份有限公司提供，批号20111205，氯化钡( 广东省精细化学品工程技术研究开发中心) 海藻酸钠( 上海精细化工科技有限公司) ，水为超纯水。

1. 2 仪器

Microinfusion Pump WZ - 50C2 ( 浙江大学医学仪器有限公司) ，电子天平AL204( 梅特勒- 托利多仪器( 上海) 有限公司) ，TGL80 - 2B 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) ，85 - 2 型恒温磁力搅拌器( 巩义市予华仪器有限公司) ，GF-Ⅱ高压静电发生器( 苏州市自晟涂装工程有限公司) ，冷冻干燥机FD - 1( 北京德天佑科技发展有限公司) ，Waters高效液相色谱仪( 600Pump; 600 Controller; Water 2487 Dualλ Absorbance Detector) ( 美国沃特世公司) ，Ql - 901 涡旋混合器( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ，AS - 20500A超声波清洗器( 天津奥特赛恩斯仪器有限公司)

2 实验方法和结果

2. 1 人参皂苷Rg3 自微乳的制备

以平衡溶解度、伪三元相法筛选出最佳的自乳化处方为Cremophor Rh40: Triton X100( 1 ∶ 1) /Isopropanol /Ethyl oleate/H2O = 0. 32 ∶ 0. 32 ∶ 0. 26 ∶ 0. 10 ∶ 2. 00，按相应质量比称取上述处方各成分于烧杯中，用恒温磁力搅拌器于37 ℃搅拌至澄清透明状，即为空白微乳。取上述配制的空白微乳，向其中加入过量的人参皂苷Rg3 原料药，磁力搅拌10min，取出，以8500rpm 的转速离心20 min，吸取上清液，即为人参皂苷Rg3 微乳。制得载药自微乳体系，用于后续微球制备的模型药物。

2. 2 微球的制备

精密称取海藻酸钠，加到“1. 2. 1”项下的人参皂苷Rg3微乳中，( 海藻酸钠与纯水的比例为1. 5 ～ 2. 0 ∶ 100) ，磁力搅拌器中搅拌约1. 5 h，使海藻酸钠完全溶解并混合均匀。再精密称取BaCl2溶在50 mL 的纯水中得30 mmol /L 的BaCl2溶液。将海藻酸钠与微乳的混合液体置于特定的20mL 注射器内，使微泵上注射器针头的底端与BaCl2溶液的液面相距约2 cm，节微泵的速度为30 mL/h，BaCl2溶液中放入磁石，在磁力搅拌器中不断搅拌。将高压静电发生器的负极连接注射器的针头，正极放入BaCl2溶液中，微泵开始注射。当液滴开始从注射针头滴下后缓慢调节高压静电的电压，注射完之后取2 mL BaCl2溶液待检测，并收集BaCl2溶液中的微球，用纯水洗涤即得湿态微球。将湿态微球置于- 80 ℃的条件下预冻4 h 以上，再于冷冻干燥机内冻干24 h，则得到干燥微球，称重。

2. 3 人参皂苷Rg3 含量测定方法的建立

2. 3. 1 色谱条件色谱柱: Kromasiol ODS - C18柱( 4. 6mm × 240 mm，5 μm) ; 流动相: 磷酸( 调pH = 2) : 乙腈=48 ∶ 52; 进样量: 20 μL; 流速: 1. 0 mL/min; 检测波长: 203nm; 柱温: 40 ℃。

2. 3. 2 对照品溶液的配制精密量取约人参皂苷Rg3 粉10. 50 mg 于100 mL 容量瓶中，加甲醇涡旋震荡片刻，再超声10 min 使其完全溶解，并稀释至刻度，摇匀得浓度为105μg /mL 的对照品溶液，备用。

2. 3. 3 标准曲线的制备及线性关系考察精密吸取

2. 3. 2 项下的对照品溶液5. 00 mL，稀释2 倍，配成浓度为52. 5 μg /mL 对照品溶液，再进一步稀释，分别配成浓度为0. 5、5. 25 μg /mL 的对照品溶液。进样20 μL，以进样浓度( X) 为横坐标，峰面积( Y) 为纵坐标，并以最小二乘法进行线性回归，计算回归方程y = 6 898. 6x + 4 689. 9，R2 = 0. 9998。结果表明: 人参皂苷Rg3 进样浓度在5. 25 ～ 105 μg /mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2. 3. 4 供试品溶液的配制准确称取“2. 2”项下制备的人参皂苷Rg3 微乳微球4. 94 mg，于5 mL EP 管中，用2. 00mL 的甲醇超声溶解10 min，在14800 r /min 转速下离心3min，取上清液即得供试液。同法制备不含人参皂苷Rg3 的空白阴性对照液。

2. 3. 5 专属性实验分别吸取人参皂苷Rg3 的对照品和供试品溶液以及空白自乳微球溶液20 μL 注入高效液相色谱仪中。结果显示，空白自微乳化微球溶液对检测无干扰，说明该方法对人参皂苷Rg3 的检测专属性良好。

2. 3. 6 精密度和回收率实验精密吸取空白自微乳化微球溶液100 μL 共3 份，分别于5 mL EP 管中，再向其中加入人参皂苷Rg3 对照品储备液( 0. 5、1、1. 5 mL) ，涡旋混匀。按“2. 3. 1”下色谱条件进行测定人参皂苷Rg3 的`含量，计算日内精密度、日间精密度( n = 3) 和回收率( n = 5) 。结果，人参皂苷Rg3 高、中、低3 种浓度日内、日间精密度分别为1. 4%、1. 9%、1. 67% 和1. 73%、1. 53%、2. 01%，人参皂苷Rg3 低、中、高3 个浓度的回收率分别为98. 27%、98. 41%、99. 05%，RSD 为1. 31%、1. 28%、0. 69%。以上实验结果表明，该法准确可靠。

2. 4 微球的质量评价

2. 4. 1 微球的物理特性光学显微镜下观察新制的微球，结果显示微球外观圆整，表面光滑，分散均匀且不粘连，见插页Ⅻ图1。随机取冷冻干燥后的微球，进行喷金处理，然后于电镜下放大200 倍和500 倍观察微球表面形态，见插页Ⅻ图2，可见到孔状结构; 放大30 倍考察其粒径分布，见插页Ⅻ图3。结果显示湿态时微球的平均粒径在1. 5 ～ 2. 00 mm 左右，而冻干状态下微球的平均粒径为0. 8 ～ 1. 0 mm。

2. 4. 2 自乳化微球的重分散性随机取60 个微球，随机分成3 份，分别置于一定量的pH2 的盐酸溶液中、等量纯水中和等量的pH6. 8 的磷酸缓冲液中，在恒温磁力搅拌器上低速搅拌，并控制温度在37 ℃。结果显示在盐酸溶液中和纯水中的微球不溶胀，在pH6. 8 的缓冲溶液中的微球在10 ～ 40 min 内微球开始溶胀，70 min 时所有微球都完全溶胀破裂，均匀分散，成澄清透明，有淡蓝色乳光的溶液，说明自乳化微球基本保持人参皂苷Rg3 自乳化特性。

2. 4. 3 包封率的考察准确称量冻干的人参皂苷Rg3 自乳化微球12. 62 mg 于干燥试管中，用10 mL 甲醇稀释并超声溶解，再在14800 r /min 条件下离心3 min，取上清液20μL 用HPLC 测定含量。根据《中华人民共和国药典》中对微球的相关规定按如下公式计算包封率: 包封率% = ( 系统中的总药量- 液体介质中未包封的药量) /系统中的总药量× 100%微球的包封率为85. 3%。

2. 5 微球形成的影响因素

2. 5. 1 搅拌速度对微球的影响相同浓度的BaCl2溶液，分别以低速、中速、和高速的搅拌速度搅拌，观察微球的形成情况，见表1，结果显示搅拌速度对微球形成几乎没有影响。

3 讨论

庞焕等对参一胶囊进行人体药代动力学研究，发现口服3. 2 mg /kg 后血药浓度很低，最大血药浓度Cmax值仅为( 16 ± 6) ng /mL。为了促进人体Rg3 的体内吸收，以微乳为载体研制成自微乳制剂来提高其溶解度和生物利用度，而固体的自乳化系统既能克服液体剂型储存等不便因素，又保持自乳化给药系统的优点，故本研究采用静电滴制法制备人参皂苷Rg3 自乳化海藻酸钠微球。在海藻酸微球的制备中发现: ( 1) 海藻酸与氯化钡的浓度是关键; ( 2)随着海藻酸钠的浓度增大，微球的包封率会上升但是拖尾严重且固化时间会延长; ( 3) 滴制时控制高压静电的电压，一定范围内，随着电压差增大微球的粒径会减小，选择使液滴尽可能小但又不会飘，本实验最终调节电压约为500V最为理想; ( 4) 对微球形成的影响因素的实验表明缩短固化时间可降低药物的流失从而提高药物在微球中的含量。通过单因素分析，优化载药微球的制备的条件: 海藻酸的浓度为1. 5%，氯化钡溶液的浓度为30 mmol /L。按上处方、条件制备的微球平均粒径为1. 0 mm 左右、表面性能及球形度好、无聚集现象，但部分还稍有拖尾，微球的包封率较高，达到《中华人民共和国药典》的标准。而制备的微球在PH6. 8 磷酸盐溶液中70 min 即溶胀，在水、盐酸中不溶胀，表明该微球既有自微乳的特性又有肠溶的特性。

采用静电滴制、以海藻酸与氯化钡为基本处方制备的载药微球，条件温和，不需要有机溶媒，设备和工艺简单易行，模型药物选择广泛，尤其对难溶性药物、对药物粒径要求不高( 口服制剂) 的有优势。