深究枸杞多糖对亚健康小鼠免疫功能的影响论文

深究枸杞多糖对亚健康小鼠免疫功能的影响论文

亚健康状态(sub-health)是指人体处于疾病与健康之间的一种状态。亚健康已成为危害人类健康的隐患之一。亚健康状态以疲劳、活力减退、免疫力降低为主要的临床表现。现代西医药学对亚健康状态缺乏有效的治疗手段，而中医药在该方面积累了丰富的经验，显示出独特的优势。亚健康与中医“未病学”的预防观念不谋而合。治未病是中医药的特色，而亚健康属未病范畴，且是未病之核心。枸杞子系茄科宁夏枸杞的干燥成熟果实，为传统中药，其所含的多糖作为一种天然植物多糖，既具有丰富的生物活性，又无毒副作用，无论在临床应用还是保健类食品开发方面均具有广阔的前景。多糖是目前国内外的研究热点之一。本实验采用4种复合因素建立亚健康状态小鼠模型，观察枸杞多糖对其改善作用并探讨其机制，为枸杞多糖的临床应用提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级健康昆明小鼠，雄性，50只，4周龄，18～22g，购自长春生物制品研究所有限责任公司，动物合格证号：scXK(吉)2011-0003。

1.2主要试剂

CD3-APC-Cy7、CD4-PE和CD8-FITC单克隆抗体购自美国BD公司;SOD、CAT、MDA、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(Dopamine，DA)试剂盒购自南京建成生物制剂公司;RNA反转录试剂盒购自TRANSGEN公司;ConA和LPS购自美国Sigma公司;Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。

1.3枸杞多糖的制备

将枸杞子烘干、粉碎，以氯仿：甲醇(2：1)回流脱脂后，用80%乙醇回流，残渣加蒸馏水于80℃提取，滤液减压蒸馏浓缩，浓缩液中加入95%的乙醇，冰箱冷藏静置12h后，离心，沉淀物依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥获得枸杞多糖，粗多糖得率为5.28%。采用硫酸-苯酚法测定多糖含量为3.75%。

1.4亚健康模型小鼠的建立将50只昆明小鼠适应1周后，取10只作为对照组，取40只进行建模，采用游泳、睡眠剥夺、束缚、应激4种复合因素刺激建模。游泳：制作直径为70cm的游泳池，水深30cm，水温约25℃，每天分别于8：00和14：00将建模鼠放入水中，强迫游泳各50min，其余时间睡眠剥夺，直至20：00结束。睡眠剥夺：在游泳池中放置l个直径为55cm、高31cm的圆圈铁丝网平台(平台面距水面约1.0cm)，动物可自由饮水，不能睡眠，若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中。第3周开始束缚：装管束缚(50ml离心管)，保持空气通畅，小鼠禁食不禁水，于每天22：00装管，早晨6：00放出，共7d。第4周应激：每天20：00将动物从平台上取下，吹干处理，放入饲养笼中。用尖端缠有纱布的止血钳夹小鼠尾部，定期更换小鼠夹尾，使每只小鼠在建模结束时夹尾次数基本相同，每次刺激1h。22：00时去除止血钳，全天造模结束。建模28d结束称重后，将40只建模鼠剔除病鼠后，随机抽取30只，检测小鼠精神状态、外观、体重、皮毛、排便;用多功能小鼠自主活动仪检测小鼠自主活动的能力;避暗穿梭测试仪评价小鼠的记忆力;鼠尾悬挂测5min内累计不动的时间评价绝望程度;负重游泳力竭时间评价小鼠疲劳程度。

1.5动物分组及给药

参照预试验及《药理试验方法》进行小鼠急性经口毒性试验，测定小鼠对枸杞多糖的最大耐受量，以其1/10作为给药高剂量(400mg/kg体重)，低剂量为高剂量的1/2(200mg/kg体重)。建模结束后，用高、低剂量枸杞多糖进行小鼠灌胃，每天1次，灌胃21d，对照组和模型组给予等量蒸馏水。

1.6免疫功能的检测

1.6.1脾脏、胸腺指数的计算末次给药24h后，取各组小鼠，脱臼处死，无菌条件下迅速摘取其胸腺和脾脏组织，称重，按下式计算胸腺、脾脏指数。

胸腺、脾脏指数(mg/10g)越胸腺、脾脏重量/体重×10.

1.6.2T、B淋巴细胞增殖能力的检测取各组小鼠脾脏置于平皿内，用无血清RPMI1640液于200目尼龙网上吹打研磨，制备细胞悬液，细胞浓度调整为1×106个/ml。以ConA(终浓度为5μg/ml)及LPS(终浓度为10μg/ml)为刺激原，分别刺激T、B淋巴细胞引起增殖反应，经酶标仪检测A450值，并计算刺激指数(SI)。以加RPMI1640的细胞孔为对照孔。

SI=刺激孔(加ConA、LPS孔)A450值/对照孔A450值

1.6.3CD3、CD4和CD8的检测取1ml(106个/ml)高剂量组、对照组和模型组脾细胞悬液，1000r/min离心5min，用1mlHank’s液重悬，加入抗体(每106·694·个细胞加入CD3-APC-Cy72μl、CD4-PE5μl、CD8-FITC5μl)，常温避光孵育30min，分别设无抗体、FITC、PE、APC-CY74种对照，1000r/min离心5min，用Hank’s液重悬，洗涤3次，再用200μlHank’s液重悬，上流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群计数。

1.7抗疲劳能力的测定

1.7.1游泳力竭时间取各组小鼠，鼠尾悬挂小鼠体重10豫的铁圈，以鼻尖沉于水下10s后结束时间记录，用于评价小鼠抗疲劳程度。

1.7.2下丘脑单胺类神经递质含量测定取高剂量组、对照组及模型组禁食小鼠,冰台上断头取脑，迅速取出下丘脑称重后，加入0.9豫的氯化钠溶液低温匀浆，4℃，3500r/min离心20min，取上清液，ELISA法检测5-HT和DA的含量。

1.7.3海马脑区谷氨酸受体NR2AmRNA表达水平的检测取高剂量组、对照组及模型组处死的小鼠，迅速冰上打开颅腔，取出海马，在装有液氮的研钵中研磨，用Trizol提取RNA，经反转录试剂盒反转录为cDNA，以其为模板进行Real-TimePCR扩增反应，反应体系：10μlSYBRGreenPcrMasterMix，2μlcDNA，0.4μl上游引物(10μmol/L)，0.4μl下游引物(10μmol/L)，RoxrefrenceDye(50×)，7μlddH2O。反应条件：95℃预变性5min;95℃变性5s，61℃退火31s，共40个循环。-20℃保存，采用荧光定量PCR仪检测。

1.8统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以均值依标准差(x依s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1亚健康模型小鼠的一般状况模型小鼠烦躁、易激惹、撕咬，2周后精神倦怠，皮毛欠光泽，排便稀;对照组小鼠行为表现无异常。模型组小鼠体重明显低于对照组(P<0.05)，即复合因素造模影响动物的生长发育和新陈代谢，与亚健康者体重减少表现相似;模型组小鼠自主活动次数明显少于对照组(P<0.05)，且表现出精神倦怠;模型组小鼠避暗穿梭次数明显多于对照组(P<0.01)，即记忆力明显差于对照组小鼠，符合亚健康状态记忆力降低的情况;模型组小鼠呈现间歇性挣扎，挣扎时间明显短于对照组;模型组小鼠先沉于水下，力竭时间明显短于对照组(P<0.05)。上述结果均符合亚健康基本特性，亚健康建模成立。

2.2枸杞多糖对亚健康小鼠免疫功能的影响检测结果表明，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数均明显低于对照组(P<0.01或P<0.05)，枸杞多糖高剂量组小鼠胸腺指数、脾脏指数明显高于模型组(P<0.05);各组间T细胞增殖能力无显著变化;模型组小鼠B细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)，枸杞多糖高剂量组B细胞增殖能力明显高于模型组(P<0.05)。表明给药后胸腺指数、脾脏指数升高，B细胞增殖能力增加，体液免疫能力提高。模型组小鼠CD4+T淋巴细胞明显较少，CD4+/CD8+值显著降低(P<0.05);枸杞多糖高剂量组CD4+/CD8+值明显高于模型组(P<0.01)，但未达到正常值。表明给药后明显改善了T细胞亚群的免疫失衡状态。

2.3枸杞多糖对亚健康小鼠抗疲劳的作用检测结果表明，模型组小鼠先沉于水下，体力明显弱于对照组小鼠(P<0.05);枸杞多糖高剂量组和低剂量组小鼠体力明显高于模型组小鼠(P<0.05);且高剂量组明显高于低剂量组(P<0.05)。模型组小鼠下丘脑DA含量明显低于对照组(P<0.05)，5-HT含量明显高于对照组(P<0.01)，枸杞多糖高剂量组DA含量较模型组明显提高(P<0.05)，5-HT含量较模型组显著降低(P<0.01)。模型组小鼠海马区NR2AmRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.01)，枸杞多糖高剂量组NR2AmRNA表达水平明显高于模型组(P<0.05)，表明给药后抑制了兴奋性氨基酸类神经递质传导的异常。

3、讨论

亚健康状态是介于健康与疾病的边缘状态，是机体在无器质性病变情况下发生的一些功能性的改变。综合考虑亚健康的成因和表现，本实验采用游泳、睡眠剥夺、束缚、应激4种复合因素建立亚健康小鼠模型。通过对其体重变化、自主活动量、避暗次数、鼠尾悬挂5min内累计不动时间、负重游泳力竭试验时间的统计验证了亚健康模型，表明该造模方法具有一定的合理性，为下一步实验奠定了基础。亚健康最主要最常见的临床症状是免疫力降低和疲劳。为发挥中药在治未病中的.优势，以提高免疫力和抗疲劳能力来预防亚健康为切入点，本实验采用高、低剂量枸杞多糖进行干预，研究其改善亚健康的作用。

胸腺与脾脏作为机体的主要免疫器官，其重量的改变可反映受试药物对免疫系统的刺激作用。实验结果表明，枸杞多糖可增加模型小鼠胸腺指数、脾脏指数，且高剂量组明显高于低剂量组(P<0.05)。T淋巴细胞是细胞免疫的重要参与者，在受到特异性抗原如ConA的刺激后，转化为淋巴母细胞，反映机体细胞免疫功能的强弱;B淋巴细胞在受到抗原如LPS的刺激后，先转化为浆母细胞，再分化为浆细胞，合成并分泌抗体，参与体液免疫。实验结果显示，模型小鼠的B淋巴细胞增殖能力明显下降(P<0.05)，表明小鼠建模后机体的体液免疫功能下降，给予枸杞多糖干预后，可不同程度提高亚健康小鼠的B淋巴细胞增殖能力，但T淋巴细胞建模前后及用药后无明显改变。表明枸杞多糖可有效提高亚健康小鼠的体液免疫功能。CD4+/CD8+值的失调与感染性疾病、过敏性疾病及自身免疫性疾病相关。脾淋巴细胞CD4+/CD8+值可评价亚健康中免疫功能的微观机制。实验结果表明，亚健康小鼠CD4+/CD8+值降低，经枸杞多糖干预后，CD4+/CD8+亚群比例明显增加(P<0.05)。表明枸杞多糖改善了T细胞亚群的免疫失衡状态。

慢性疲劳是亚健康状态最典型的表现之一。从力竭游泳时间上来看，模型组小鼠先沉于水下，体力明显不如对照组小鼠，枸杞多糖高、低剂量组小鼠体力明显高于模型组小鼠(P<0.05)。5-HT在脑内的合成增加，可使脑部对其他疲劳信号的敏感性增强，使机体运动能力下降。脑内5-HT增加，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴和体温调节等因素的变化而影响运动性疲劳的产生。模型组小鼠下丘脑5-HT含量较对照组明显增高(P<0.05);枸杞多糖高剂量组与模型组相比5-HT含量有所降低，表明枸杞多糖能抑制5-HT合成，降低其在下丘脑中的含量。DA是一种中枢神经递质，主要分布于纹状体，起抑制作用。随着运动性疲劳的发生，DA浓度下降，活性减弱，降低肌肉活动的协调性，导致疲劳的发生。枸杞多糖干预后，高剂量组下丘脑DA含量明显高于模型组(P<0.05)，推测枸杞多糖高剂量可提高DA活性，抑制其降解。下丘脑单胺类神经递质DA和5-HT的代谢紊乱，是亚健康产生各种症状的微观机制。枸杞多糖可能是通过调节神经递质而发挥改善亚健康小鼠抗疲劳的作用。

NR2A是一种配体门控离子通道，具有一定的可调控性，某些内外环境的变化将直接或间接影响NR2A蛋白含量及其基因表达，从而对NR2A的功能产生影响，进而影响整个大脑的功能，导致机体兴奋性下降，出现疲劳、健忘及精神情绪的异常。检测海马脑区谷氨酸受体NR2A蛋白含量和基因表达，可反映亚健康疲劳、健忘等症状产生的微观机制。实验结果显示，复合因素造模可降低小鼠NR2AmRNA的表达水平，导致兴奋性氨基酸类神经递质的传导出现障碍，这可能是模型动物运动能力下降的原因之一。枸杞多糖可上调NR2AmRNA的表达水平，抑制兴奋性氨基酸类神经递质的传导异常，从而减轻疲劳。综上所述，采用复合因素建立的亚健康小鼠模型，动物的各项指标符合亚健康的特征。枸杞多糖对亚健康小鼠有增强免疫力和抗疲劳的作用，且枸杞多糖高剂量组效果优于低剂量组。本实验为枸杞多糖的临床应用提供了实验依据。