关于医药卫生的论文：浅探肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

0引言

肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌. 随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗在预防和控制SPN感染中的作用越来越重要［1］. SPN根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的发展方向. 研究发现的SPN蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolytic protease P, ClpP）是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶［2］，其在SPN的生存、致病和入血过程中起着重要的作用［3-4］，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值. 本研究探讨ClpP在不同SPN菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型SPN中表达情况，旨在为自主开发SPN蛋白疫苗奠定基础.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种与质粒12株不同血清型SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)，CMCC(B)31 203(serotype 3)，CMCC(B)31 446(serotype 4)，CMCC(B)31 011(serotype 5)，CMCC(B)31 207(serotype 6B)，CMCC(B)31 507(serotype 7F)，CMCC(B)31 216 (serotype 9V)，CMCC(B)31 614 (serotype 14)，CMCC(B)31 687(serotype 18C)，CMCC(B)31 693(serotype 19F)，CMCC(B)31 759(serotype 23F)（北京中国医学细菌保藏管理中心），NCTC7466 (serotype 2，国际通用名为D39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌DH5a和原核表达系统(含pET32a(+)/ClpP重组质粒)E.coli BL21(DE3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒PMD18T载体试剂盒(日本TaKaRa公司).

1.1.2试剂DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒DNA快速制备试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶EcoRI，SacI，高保真LA Taq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大连宝生物技术公司)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)(美国Sigma公司)；DNA marker(上海生工公司)；Goatantimouse IgG HRP(H+L)和3二氨基苯联胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris碱(美国BBI公司)；His Bind Column(NiNTA)镍柱(美国Novagen公司).

1.1.3仪器热循环仪（TMBioRad PCR，美国gene cycle公司）； 电泳仪（Power/PAC200，美国BioRad公司）.

1.1.4动物BALB/c小鼠，雌性，8~10 wk龄，体质量18~20 g（重庆医科大学实验动物中心）.

1.2方法

1.2.1聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因将12株SPN在C+Y培养基中增菌至对数生长中后期，按试剂操作说明书分别提取基因组DNA，扩增ClpP的开放读码框架(591 bp). 上游引物：5′CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT3′，含EcoRI位点；下游引物：5′CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG3′，含SacI位点，引物由上海生工生物技术公司合成. 使用La Taq高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因组DNA为模板进行扩增. PCR体系: ddH2O 13.7 μL，5×buffer(含Mg2+) 6.0 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.4 μL，P1(5 pmol/L) 3 μL，P2(5 pmol/L) 3 μL，SPN DNA 1.5 μL，LA Taq 0.4 μL. 在PCR仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5 min后反应30个周期：94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min. 末轮后72℃延伸 5 min. 取5 μL反应产物置10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物.

1.2.2TA克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个PCR产物克隆至PMD18T载体，转入DH5α感受态细胞，在Amp+LB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定［文章来源于 www.qwen.cn］，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序.

1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用DNAssist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与GenBank数据库对已公布的TIGR4 SPN全基因组序列进行相似性分析.

1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具ANTIGENIC PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES分析不同血清型SPN ClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.

1.2.5PETClpP重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统pET32a(+)/ClpPE.coli BL21(DE3)在终浓度1 mmol/L IPTG，37℃，250 r/min条件下诱导目的重组蛋白ClpP的表达. 收集的菌体超声波碎菌后，采用NiNTA柱纯化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表达与提纯效果. 将透析除盐的纯化蛋白溶液经Bradford法定量后备用.

1.2.6antiClpP抗血清的制备稀释后重组clpP蛋白溶液与等体积的CFA或IFA充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白. 初次免疫时小鼠接受含200 μL(含重组蛋白10 μg)的CFA与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受200 μL(含重组蛋白10 μg)的IFA与重组蛋白混合物. 小鼠经3次免疫后，分离小鼠血清，并用ELISA法测其antiClpP抗体效价.

1.2.7Western Blot检测将12株SPN在C+Y培养基中增菌至对数生长中后期（A620 nm 0.5~0.6左右），各取2 mL菌液离心取沉淀. 沉淀用PBS洗3次，用1×上样buffer处理后，于100℃水浴5 min. 全菌裂解物经SDSPAGE电泳分离后转膜. 以antiClpP多克隆抗体为一抗（1∶400)，羊抗鼠HRPIgG为二抗（1∶5000），DAB为显色底物，Western Blot检测菌体中ClpP蛋白的表达，以金黄色葡萄球菌作为对照.

2结果

2.1目的基因PCR产物12株细菌的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见清晰的扩增条带，产量高，所有PCR产物的分子大小一致，都位于600 bp左右(图1).

2.2TA克隆载体的构建与鉴定将12个重组克隆质粒双酶切后，经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，于期望位置上出现目的条带(图2)，证明ClpP开放读码框架正确克隆入PMD18T载体，同时菌落PCR结果也证明基因克隆正确.

2.3测序结果与序列比对不同株的ClpP基因编码区大小与TIGR4菌株中ClpP基因一样，均为591 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码196个氨基酸，基因序列一致性超过99%. 由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为99.5%以上. 经生物学信息软件分析结果显示，serotype 4，5，6B 三菌株ClpP氨基酸序列与TIGR4菌株ClpP氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，serotype 1 SPN与TIGR4菌株ClpP氨基酸序列仅存在着两个氨基酸的差异，其余血清型与TIGR4菌株ClpP氨基酸序列完全一致.

2.4抗原表位分析结果12株SPN ClpP蛋白的抗原表位数目相同（分别含7个抗原表位）并且氨基酸组成及分布完全一致.

2.5融合蛋白及其antiClpP抗体效价转化菌经IPTG诱导后，较未诱导菌有一条明显增粗的蛋白条带，Mr约为42×103左右，与期望值相符合（ClpP蛋白约为Mr 21×103，再加上Mr 21×103左右的硫氧还蛋白）. 蛋白溶液经镍离子柱亲和层析后透析，SDSPAGE证明纯化产物为单一蛋白，纯度达90%. 该蛋白免疫小鼠后用ELISA法测得的血清效价为1∶68 000（图3）.

2.6ClpP蛋白的表达SPN全菌裂解物经电泳分离后，与制备的antiClpP血清反应，12型SPN全菌裂解物Mr均在21×103的位置出现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现(图4). 提示不同血清型SPN中均有ClpP蛋白抗原的表达.

3讨论

蛋白疫苗是SPN的第三代疫苗. 目前认为理想的SPN蛋白质疫苗的标准应包括:能在细胞壁表达或者以分泌方式表达、在人体内抗原性高、能诱导杀菌的抗体和具有高度的保守性. 随着基因组学与蛋白组学的发展，SPN毒力相关蛋白候选疫苗不断地被筛选出来. 但是一些蛋白由于等位基因的变异［5-7］，针对于该蛋白的抗体升高不能识别其等位基因变异的表达产物，从而不能诱导针对不同血清型菌株广泛的免疫保护. 因此，候选疫苗是否具有诱导高水平、能与不同种类的型或亚型菌株起交叉反应的抗体的能力，是很多致力于SPN疫苗的专家不断寻找高保守蛋白疫苗的原因［8-9］.

我们要评价ClpP候选蛋白疫苗的价值就应考虑其在不同血清型SPN的保守性，并考虑ClpP是否在SPN菌体中表达. 本研究选用分离自不同标本并且在中国比较常见的［10］12株不同血清型SPN进行研究，结果发现，在12株菌中ClpP基因相当保守，其抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致，无抗原位点的突变，而且12株SPN菌体蛋白中都有ClpP蛋白的表达. 我们的结果初步表明：ClpP在不同血清型SPN中高度保守，在不同型菌体中都有表达.

细胞壁表达的高保守性蛋白是首选的疫苗靶点. 目前研究较多的几个SPN蛋白质疫苗如PspA［11］，PspC［6］和PLY［12］等，PspA和PspC虽在细胞壁表达，但由于等位基因变异，保守性相对较差；PLY虽具有较高的保守性，但在细胞内表达，其抗体难以透过细胞壁与之结合，疫苗保护效果难以得到保证. 而ClpP在SPN热休克后从细胞内向细胞壁易位［3］，同时具有高度的保守性，因此它是SPN很好的疫苗靶点，将其单独使用或与其他的蛋白疫苗组合使用，可能会使SPN蛋白疫苗的研究取得突破性进展，从而为我们自主开发广保护范围的SPN疫苗提供理论基础.

另外我们也采用了BLAST方法分析了SPN ClpP与邻近种属细菌ClpP基因序列的相似性，发现SPN ClpP与许多其它种属细菌的ClpP基因序列具有高度的同源性，比如SPN的ClpP与唾液酸链球菌ClpP的预测氨基酸序列相似程度为87%~88%，与无乳链球菌ClpP的预测氨基酸序列相似程度为91%~92%. ClpP可能在这些菌属中存在相同的抗原表位，并可能诱发交叉反应，这应该引起注意. 总之，在大规模人类免疫接种前对这类高保守蛋白进行彻底的安全性调查，将是非常必要的.

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